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细胞凋亡 (Apoptosis)
在细胞的“花样”死亡方式一文中，小 M 已经介绍过细胞的死亡方式有十几种，凋亡只是其中一种：细胞凋亡 (Apoptosis)，又称程序性细胞死亡，是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。
与被动的细胞坏死不同，细胞凋亡是主动发生的，是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程，期间涉及一系列基因的灵活、表达以及调控等。
图 1. 细胞凋亡的信号通路[1]
细胞凋亡的主要形态学特征包括：染色质固缩、DNA 片段化、细胞膜起泡、细胞皱缩、凋亡小体的形成等。
图 2. 细胞凋亡过程
细胞凋亡的检测
细胞凋亡，我们该如何检测呢?
目前至少有数十种检测细胞凋亡的方法，可以大致划分为基于细胞形态、生物学功能和生化标记三大类。
■ 基于细胞形态学的方法
1.1 电子显微镜检测
电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡经典、可靠的方法，被认为是确定细胞凋亡的金标准。细胞凋亡的主要形态学特征包括：染色质固缩、DNA 片段化、细胞膜起泡、细胞皱缩、凋亡小体的形成等。
图 3. BBR 和 DDP 诱导下 OVCAR3 细胞的凋亡形态[2]
1.2 细胞核染色检测
细胞凋亡时，细胞膜通透性增强，染色质发生固缩，故经 DAPI、Hoechst系列等荧光染料染色后可快速检测细胞凋亡。除了实验操作简单、成本低廉之外，细胞核染色还可以定量。
图 4. PC-3 细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化[3]
注：Hoechst 33342 染色观察到核碎裂和核凝结。用 0、0.3、0.6、0.9 和 1.2 mg/mL 的茎提取物处理 PC-3 细胞 24h 后，细胞出现典型的凋亡细胞核形态变化。照片在 20× 荧光显微镜下拍摄。箭头表示凋亡细胞。
■ 基于生物学功能的方法
2.1 线粒体膜电位的检测
凋亡早期细胞，线粒体膜通透性增加，线粒体膜电位 (ΔΨm) 下降甚至消失。线粒体膜电位的下降被认为是细胞凋亡过程中近早发生的生物学变化。一旦线粒体膜电位被破坏，细胞凋亡将不可逆转。
目前常用一些亲脂性阳离子染料如 JC-1 (HY-K0601) 检测线粒体膜电位的变化。线粒体膜电位较高时，JC-1 在基质中汇聚形成聚合物，可以产生红色荧光 (Ex/Em=585/590 nm)；线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体基质中，以单体形式存在产生绿色荧光 (Ex/Em=510/527 nm)。
图 5. JC-1法检测 KRA-533刺激下不同细胞的线粒体膜电位变化[4]
2.2 细胞膜表面磷脂酰丝氨酸 (PS) 的检测
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸 (PS) 位于细胞膜内侧；细胞凋亡早期，PS 会外翻到细胞膜外侧。Annexin V (膜联蛋白 V) 是一种 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，可与 PS 特异性结合，因此 Annexin V 常作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。Annexin V 经 FITC 标记后可发绿色荧光。碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 染色液是一种不能穿透细胞膜的红色荧光染料，可对凋亡晚期细胞及坏死细胞染色。
经 Annexin V-FITC 和 PI 联合染色后，正常细胞基本无荧光 (Annexin V-/PI-)，早期凋亡细胞呈绿色荧光 (Annexin V+/PI-)，晚期凋亡细胞及坏死细胞则呈绿色和红色荧光 (Annexin V+/PI+)。
图 6. 不同浓度臭椿酮诱导 A375 细胞的凋亡情况[5]
此外，除了用 FITC 标记 Annexin V 之外，也可以用 EGFP、PE、mCherry 等作为荧光探针哦。
■ 基于生化标记的方法
3.1 凋亡分子标记检测
Caspase (cysteinyl-aspartic acid proteases) 蛋白家族在介导细胞凋亡过程中具有重要的作用。绝大多数情况下，所有的凋亡信号都会汇集到凋亡的执行者 Caspase-3 上。在正常细胞中，Caspase-3 以酶原形式存在，在凋亡早期 Caspase-3 被灵活，并执行过后的凋亡程序。因此可以通过检测 Caspase 3 剪切体的含量或 Caspase 3 的活性来反应细胞凋亡过程。此外，也可以通过检测 Caspase-3 的底物——PARP 蛋白的含量来检测细胞凋亡。
图 7. ZnO-NPs 诱导牙龈癌细胞的凋亡情况[6]
3.2 DNA 片段化检测
在细胞凋亡的后期，Caspase 会灵活 Caspase-Activated DNase (CAD)，切割核小体之间的 DNA，形成以 180-200 bp 为单位的 DNA 片段，经琼脂糖电泳后形成 DNA ladder。
图 8. DNA 片段化检测 MCP30 诱导下 Ishikawa H 细胞的凋亡情况[7]
注：泳道 1-4 分别表示 0 pM、8.33 pM、333.33 pM 和 666.67 pM MCP30 诱导 72h 的 Ishikawa H 细胞
3.3 DNA 片段原位检测 (TUNEL 法)
细胞凋亡时，相关 DNA 内切酶被灵活，进而切断核小体间的基因组 DNA，产生 180-200 bp 的 DNA ladder，暴露的 3’-OH 在末端脱氧核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上特异荧光探针标记的 dUTP，借助荧光显微镜或流式细胞仪即可检测细胞凋亡的发生。
图 9. TUNEL 法检测苦参碱刺激下 HepG2 细胞凋亡情况[8]
看了这么多，相信大家对细胞凋亡的检测方法都有了大概的了解。M** 现已推出细胞凋亡检测相关试剂盒，心动不如行动，来 M** 官网查询具体的产品信息吧！
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参考文献
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3. Chainumnim S, Saenkham A, Dolsophon K, et al. Stem Extract from Momordica cochinchinensis Induces Apoptosis in Chemoresistant Human Prostate Cancer Cells (PC-3). Molecules. 2022, 27(4): 1313.
4. Xu K, Park D, Magis AT, et al. Small Molecule KRAS Agonist for Mutant KRAS Cancer Therapy. Mol Cancer. 2019, 18(1): 85.
5. Liu W, Liu X, Pan Z, et al. Ailanthone Induces Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Melanoma B16 and A375 Cells. Biomolecules. 2019, 9(7): 275.
6. L SW, Lee CH, Lin MS, et al. ZnO Nanoparticles Induced Caspase-Dependent Apoptosis in Gingival Squamous Cell Carcinoma through Mitochondrial Dysfunction and p70S6K Signaling Pathway. Int J Mol Sci. 2020, 21(5): 1612.
7. Gu HZ, Lin RR, Wang HC, et al. Effect of Momordica charantia protein on proliferation, apoptosis and the AKT signal transduction pathway in the human endometrial carcinoma Ishikawa H cell line in vitro. Oncol Lett. 2017, 13(5): 3032-3038.
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原文章链接：https://www.caigou.com.cn/news/2022110256.shtml
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