从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上,如果物体恰在焦点上,那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源,这就是所谓的共聚焦,简称共焦。其意义是:通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。共聚焦显微镜能提供无比精确的三维成像,以及对亚细胞结构和动力学过程的**测试。
共焦显微技术是由美国科学家M.Minsky在1957年提出的,当时的主要目的是消除普通光学显微镜在探测样品时产生的多种散射光。20世纪60年代通过提高扫描精度突破了普通宽场成像的分辨率限制,在20世纪80年代研制成商用共焦显微镜。共焦显微镜分为普通光照明激发和激光照明激发两种类型,而以后者应用*为广泛。
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激光扫描共聚焦显微镜是一种先进的分子生物学和 细胞生物学研究仪器。它在荧光显微镜 成像的基础上加装激光扫描装置,结合数据化图像处理技术,采集组织和细胞内荧光标记图像,在亚细胞水平观察钙等离子水平的变化,并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系。
共聚焦显微镜是近代很先进的细胞生物医学分析仪器之一。不仅可观察固定的细胞、组织切片,还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。
目前,共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究,并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段,结合其他相关生物技术,在形态学、生理学、免yi学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用。
共聚焦显微镜行业上游主要由显微光学系统、扫描装置、光源、检测器和应用软件系统等零部件厂商构成。
显微镜是共焦检测系统常用的组件,是系统成像质量的核心部分。显微镜光路一般采用无限远光学系统结构,可以方便地在其中插入光学元件而不影响成像质量和测量精度。物镜应选取大数值孔径、平场复消色差物镜,有利于荧光的采集和成像的清晰。物镜组的转换、滤色片组的选取、载物台的移动调节、焦平面的记忆锁定等都可以由计算机自动控制。
扫描装置是激光共聚焦检测系统进行大范围检测必需的组件,通常有由丝杠导轨组成的XY平移扫描、由阵镜摆动的扫描等方式。前种扫描方式可以实现大范围区域的扫描,而后者扫描范围相对小一些,不过阵镜摆动扫描可以很快,图像采集速度可以大大提高,有利于对那些寿命短的离子作荧光测定。扫描系统的工作程序由计算机自动控制,与信号采集相对应。
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光源有单色光(激光)和多色光(汞灯、氘灯、卤素灯等)。激光源可以使用多谱线氩离子激光器,它提供发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光;另外,氦氖绿激光器提供发射波长为543nm的绿光,氦氖红激光器提供波长为633nm的红光。激光源还可以用其他半导体激光器。
检测器通常采用光电倍增管(PMT)、光子计数器等,通过高速A/D转换器,将信号输入计算机以便进行图像重建和分析处理。通常在PMT前设置针孔,可以采用固定大小针孔或由计算机软件来控制的可变大小针孔。如果是检测荧光,光路中还应该设置能自动切换的滤色片组,满足不同测量的需要;也可以采用光栅或棱镜分光然后进行光谱扫描。
应用软件系统可以根据具体需要设置各种功能,但有一点是共同的,就是将扫描位置坐标与检测器接收的信号一一对应起来,并以图像的方式进行储存与显示。
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